MAP LC3γ Plasmide KO CRISPR/Cas9 (h): sc-406161

Panoramica

MAP1LC3C codifica la catena leggera 3 gamma delle proteine associate ai microtubuli 1A/1B (MAP LC3γ), un membro della famiglia ATG8 simile all’ubiquitina che durante l’autofagia viene lipidato e incorporato nelle membrane degli autofagosomi. LC3γ partecipa alla biogenesi degli autofagosomi, al riconoscimento del carico tramite motivi della regione di interazione con LC3 (LIR) e al coordinamento del flusso autofagico con la degradazione lisosomiale, collegando il sensing dei nutrienti e le risposte cellulari allo stress. Grazie al suo ruolo nella proteostasi e nel controllo di qualità degli organelli, MAP1LC3C è rilevante per vie coinvolte nel metabolismo delle cellule tumorali, nella neurodegenerazione e nella segnalazione infiammatoria, in cui un’autofagia alterata può modulare la sopravvivenza e gli output dell’immunità innata. Lo studio di MAP LC3γ aiuta a chiarire i contributi specifici delle diverse isoforme all’autofagia selettiva, inclusi mitofagia e xenofagia, e i conseguenti effetti sulle decisioni del destino cellulare.

MAP LC3γ Il plasmide CRISPR/Cas9 KO (h) è un pool di plasmidi progettato per la distruzione mirata del gene MAP1LC3C in human linee cellulari. Ogni plasmide del pool co-esprime un sgRNA unico, mirato a un sito distinto all'interno del locus MAP1LC3C, insieme alla nucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes, e codifica per la GFP per consentire l'identificazione fluorescente e l'arricchimento delle cellule trasfettate con successo. Questa strategia multi-guida aumenta la probabilità di indurre spostamenti di lettura o delezioni che producono un knockout funzionale, offrendo un'alternativa più robusta agli approcci a guida singola. Le DSB indotte in più siti vengono risolte tramite giunzione non omologa (NHEJ) o, se utilizzate con il modello donatore HDR incluso, tramite riparazione diretta dall'omologia (HDR) in un sito bersaglio definito all'interno del locus.

Se utilizzato in combinazione con il donatore HDR che esprime RFP, la fluorescenza GFP e RFP può essere utilizzata insieme per distinguere le popolazioni cellulari trasfettate da quelle modificate, semplificando i flussi di lavoro di selezione e selezione dei cloni basati sulla citometria a flusso.

Donatore per riparazione diretta dall'omologia (HDR) — Cassetta puromicina con reporter RFP

Per applicazioni che richiedono cloni knockout confermati e selezionabili, il MAP LC3γ Plasmide HDR (h) include un costrutto donatore HDR contenente una cassetta di resistenza alla puromicina (PuroR) e un reporter proteina fluorescente rossa (RFP), affiancati da bracci di omologia specifici per un sito bersaglio definito MAP1LC3C.
Se cotrasfettato con il MAP LC3γ Plasmide CRISPR/Cas9 KO (h):

• La cassetta PuroR-RFP si integra nel sito di taglio di Cas9 tramite HDR, interrompendo il frame di lettura aperto MAP1LC3C.
  La fluorescenza RFP fornisce un indicatore visivo immediato dell'integrazione riuscita, consentendo l'identificazione o la selezione basata sulla fluorescenza delle cellule modificate prima o parallelamente alla selezione con puromicina.
  Le cellule modificate con successo vengono confermate attraverso la resistenza alla puromicina, riducendo sostanzialmente il carico di screening dei cloni.
  Questa strategia di selezione è ideale per generare linee cellulari KO clonali stabili per studi funzionali a valle, screening farmacologico o sviluppo di modelli.

Sistema di rimozione della cassetta Cre-lox

Il costrutto donatore HDR presenta siti loxP che fiancheggiano la cassetta di selezione PuroR-RFP per consentire la rimozione pulita del marcatore dopo la conferma del clone. L'espressione transiente della ricombinasi Cre tramite il vettore Cre incluso : sc-418923 elimina la cassetta, lasciando un sito loxP residuo minimo all'interno del locus MAP1LC3C ed eliminando potenziali effetti confondenti sui saggi a valle.
Questo approccio in due fasi:

• Riduce al minimo la perturbazione dell'architettura cromatinica locale e degli elementi regolatori adiacenti
  Ripristina un contesto genomico quasi nativo nel locus modificato
  Consente il riutilizzo della strategia di selezione con puromicina nella stessa linea cellulare per ulteriori modifiche

Caratteristiche principali

• gRNA mirato agli esoni MAP1LC3C critici per la funzione MAP LC3γ
  Co-espressione di SpCas9 e sgRNA da un singolo plasmide per una somministrazione semplificata
  Donore HDR con resistenza alla puromicina per la selezione positiva dei cloni
  Cassetta PuroR fiancheggiata da loxP con vettore ricombinasi Cre per la rimozione senza soluzione di continuità del marcatore
  Fornito pronto all'uso per la somministrazione tramite trasfezione

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.