Maltase-glucoamylase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404265-ACT

MGAM umano codifica la maltasi-glucoamilasi, un’α-glucosidasi del bordo a spazzola intestinale che idrolizza i residui terminali di glucosio legati in α-1,4 presenti in maltosio, maltotriosio e maltooligosaccaridi, liberando glucosio libero. Questo enzima interviene nelle fasi finali della digestione alimentare di amido e glicogeno, integrando funzionalmente saccarasi-isomaltasi e modulando la disponibilità postprandiale di carboidrati sulla superficie mucosale. L’espressione e l’attività di MGAM si intrecciano con i programmi di differenziazione degli enterociti e con reti di sensing dei nutrienti che influenzano il metabolismo epiteliale. Riduzioni genetiche o acquisite della funzione di MGAM sono state associate a fenotipi di malassorbimento dei carboidrati e sono rilevanti per studi sulla disfunzione intestinale e sull’omeostasi metabolica.

Maltase-glucoamylase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MGAM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Maltase-glucoamylase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MGAM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MGAM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Maltase-glucoamylase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MGAM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Maltase-glucoamylase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Maltase-glucoamylase nelle cellule tumorali con espressione di MGAM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.