mAChR M4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402318-ACT

CHRM4 codifica il recettore muscarinico dell’acetilcolina umano M4 (mAChR M4), un GPCR accoppiato a Gi/o che modula l’eccitabilità neuronale e la trasmissione sinaptica inibendo l’adenilil ciclasi, riducendo la segnalazione mediata da cAMP e regolando l’attività dei canali ionici. M4 partecipa alle vie di neurotrasmissione colinergica e modella l’output dei circuiti dopaminergici attraverso meccanismi di segnalazione presinaptici e postsinaptici. Gli effetti a valle includono la modulazione della segnalazione MAPK/ERK, della dinamica del calcio e del rilascio di neurotrasmettitori, collegando l’attività di CHRM4 al controllo, a livello di rete, dei processi motori e cognitivi. Alterazioni della segnalazione dei recettori muscarinici e la disregolazione dei circuiti associata a CHRM4 sono state studiate nella ricerca sui disturbi neuropsichiatrici e del movimento, inclusi contesti rilevanti per la schizofrenia, i circuiti parkinsoniani e fenotipi legati all’uso di sostanze.

mAChR M4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHRM4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

mAChR M4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHRM4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHRM4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di mAChR M4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHRM4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da mAChR M4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via mAChR M4 nelle cellule tumorali con espressione di CHRM4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.