Limd1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424343-ACT

Mouse LIM domain containing 1 (Limd1) codifica una proteina adattatrice con dominio LIM che si localizza in complessi di adesione e del citoscheletro e contribuisce all’organizzazione delle adesioni focali e alla dinamica dell’actina. LIMD1 partecipa all’integrazione dei segnali nei punti di contatto cellula–matrice ed è stata collegata alla regolazione dell’output della via Hippo tramite la modulazione dell’attività di YAP/TAZ, influenzando così proliferazione, inibizione da contatto e meccanotrasduzione. Interagisce inoltre con reti di controllo trascrizionale e con segnali responsivi allo stress che modellano la progressione del ciclo cellulare e la differenziazione. Un’alterata espressione o funzione di LIMD1 è associata a una deregolazione del controllo della crescita e a fenotipi invasivi in molteplici modelli rilevanti per la malattia, rendendo Limd1 un nodo utile per lo studio di vie simili a quelle dei soppressori tumorali e della segnalazione dipendente dall’adesione.

Limd1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Limd1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Limd1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Limd1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Limd1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Limd1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Limd1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Limd1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Limd1 nelle cellule tumorali con espressione di Limd1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.