LGR4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-430724-ACT

Lgr4 codifica il recettore di membrana accoppiato a proteine G 4 contenente ripetizioni ricche in leucina (LGR4), che potenzia la segnalazione WNT/β-catenina legando le R-spondine e modulando l’attività di RNF43/ZNRF3. Nei tessuti del topo, LGR4 contribuisce a regolare il mantenimento delle cellule staminali e progenitrici, le interazioni epitelio–mesenchimali e l’organogenesi, con effetti a valle sui programmi trascrizionali che controllano proliferazione e differenziamento. L’attività di LGR4 si interseca con vie di sviluppo e di omeostasi, inclusa la comunicazione incrociata con reti di segnalazione di fattori di crescita e infiammatorie che plasmano il rimodellamento tissutale. Una deregolazione dell’asse LGR4–WNT è stata associata a fenotipi rilevanti per la biologia ossea e riproduttiva, il mantenimento dell’epitelio intestinale e contesti di segnalazione associati ai tumori, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici delle vie di segnalazione.

LGR4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Lgr4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LGR4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Lgr4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Lgr4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LGR4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Lgr4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LGR4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LGR4 nelle cellule tumorali con espressione di Lgr4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.