LAMP-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400215-ACT

LAMP2 codifica la proteina di membrana associata ai lisosomi 2 (LAMP-2), una delle principali glicoproteine della membrana lisosomiale, necessaria per la biogenesi e l’integrità dei lisosomi. LAMP-2 sostiene il flusso autofagico e le vie di degradazione lisosomiale, inclusi la macroautofagia e l’autofagia mediata da chaperoni, influenzando così il turnover di proteine, lipidi e organelli danneggiati. Attraverso il suo ruolo nel traffico endolisosomiale e negli eventi di fusione, LAMP-2 incide sulle risposte allo stress cellulare, sull’omeostasi metabolica e sulla processazione dell’antigene. Alterazioni dell’espressione o della funzione di LAMP2 sono collegate a fenotipi di accumulo lisosomiale e a disfunzioni dell’autofagia, e sono state associate a cardiomiopatia e miopatia scheletrica nella malattia di Danon, nonché a meccanismi più ampi di malattie neurodegenerative e infiammatorie che coinvolgono una compromessa capacità di clearance lisosomiale.

LAMP-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LAMP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LAMP-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LAMP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LAMP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LAMP-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LAMP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LAMP-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LAMP-2 nelle cellule tumorali con espressione di LAMP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.