karyopherin β3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402071-ACT

IPO5 codifica il recettore di importazione nucleare carioferina β3, un membro della famiglia delle transportine dipendente da RanGTP che media la traslocazione selettiva di proteine cargo attraverso il complesso del poro nucleare. Controllando il traffico nucleo-citoplasmatico, IPO5 influenza i programmi trascrizionali, la progressione del ciclo cellulare e la segnalazione in risposta allo stress, regolando la disponibilità nucleare di proteine regolatorie chiave. Alterazioni della dinamica del trasporto nucleare sono spesso associate a trasformazione oncogenica, biologia delle infezioni virali e neurodegenerazione, rendendo IPO5 un nodo rilevante per studiare come la localizzazione dei cargo rimodelli i fenotipi cellulari. Nelle cellule umane, l’importazione dipendente da IPO5 può modulare l’output delle vie di segnalazione modificando la permanenza nel nucleo di fattori di trascrizione e di altri effettori della segnalazione.

karyopherin β3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IPO5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

karyopherin β3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IPO5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IPO5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di karyopherin β3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IPO5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da karyopherin β3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via karyopherin β3 nelle cellule tumorali con espressione di IPO5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.