ICK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406371-ACT

La chinasi delle cellule intestinali (Intestinal cell kinase, ICK) è una protein-chinasi serina/treonina che si localizza nelle ciglia primarie e nel nucleo, dove regola la progressione del ciclo cellulare, la ciliogenesi e processi dipendenti dai microtubuli. Nelle cellule umane, ICK contribuisce a reti di segnalazione legate alla funzione ciliare e alla definizione dei pattern di sviluppo, incluse vie che intersecano la trasduzione del segnale Hedgehog e la dinamica del centrosoma. Alterazioni dell’attività o dell’espressione di ICK sono associate a fenotipi correlati alle ciliopatie e a disturbi dello sviluppo, in linea con il suo ruolo nel coordinare la proliferazione con la segnalazione mediata dalle ciglia. ICK è inoltre studiata in contesti in cui modifiche della segnalazione chinasi e del controllo ciliare influenzano gli stati di differenziamento e la fitness cellulare.

ICK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ICK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ICK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ICK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ICK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ICK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ICK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ICK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ICK nelle cellule tumorali con espressione di ICK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.