HOS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404203-ACT

FBXW11 codifica la proteina umana F-box/WD repeat HOS (nota anche come β-TrCP2), un componente di riconoscimento del substrato del complesso ligasi E3 dell’ubiquitina SCF (SKP1–CUL1–F-box), che indirizza la degradazione proteasomiale di proteine regolatorie fosforilate. Attraverso l’ubiquitinazione di mediatori chiave della segnalazione, HOS influenza vie che includono la segnalazione NF-κB tramite le proteine della famiglia IκB e la regolazione di Wnt/β-catenina, contribuendo così a modellare le risposte infiammatorie, la progressione del ciclo cellulare e le decisioni sul destino cellulare. Alterazioni dell’attività di FBXW11 o del riconoscimento dei substrati possono perturbare la proteostasi e l’intensità dei segnali, collegando questo asse al rimodellamento della segnalazione associato al cancro e a fenotipi immunitari/infiammatori. In quanto fattore nodale della via dell’ubiquitina, FBXW11 è spesso studiato nei contesti del controllo trascrizionale, dei degron dipendenti dalla fosforilazione e del cross-talk tra vie di segnalazione.

HOS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FBXW11 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HOS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FBXW11 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FBXW11, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HOS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FBXW11 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HOS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HOS nelle cellule tumorali con espressione di FBXW11 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.