hnRNP I Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422470-ACT

Il gene murino **Ptbp1** codifica la proteina ribonucleare nucleare eterogenea I (hnRNP I/PTBP1), una proteina legante l’RNA che regola lo splicing alternativo del pre‑mRNA, la processazione dell’estremità 3′, la stabilità dell’mRNA e la traduzione dipendente dal sito interno di ingresso del ribosoma (IRES). hnRNP I modella programmi trascrittomici specifici di tessuto e influenza le transizioni di stato cellulare controllando la selezione degli esoni in reti legate alla differenziazione neuronale, alla proliferazione e all’adattamento metabolico. Attraverso un controllo coordinato della maturazione dell’RNA e della traduzione, PTBP1 interagisce con vie che regolano il rimodellamento del citoscheletro e l’espressione genica responsiva allo stress. Un’attività deregolata di PTBP1 è stata associata a paesaggi di splicing dell’RNA alterati, rilevanti per fenotipi neuroevolutivi e per il rimodellamento oncogenico dei programmi di espressione genica, rendendola un bersaglio utile per studi meccanicistici della processazione dell’RNA.

hnRNP I Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ptbp1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

hnRNP I Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ptbp1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ptbp1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di hnRNP I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ptbp1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da hnRNP I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via hnRNP I nelle cellule tumorali con espressione di Ptbp1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.