G_{α t2} Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401528-ACT

GNAT2 codifica la subunità alfa della transducina dei coni, una proteina G eterotrimerica, Gαt2, mediatore chiave della fototrasduzione nei fotorecettori conici della retina. In seguito all’attivazione delle opsine da parte della luce, Gαt2 attiva gli effettori a valle per regolare la segnalazione dei nucleotidi ciclici, con conseguente modulazione dell’attività dei canali ionici e propagazione del segnale visivo. Questa via integra la segnalazione dei GPCR con il metabolismo del cGMP e con rapidi meccanismi di adattamento essenziali per la funzione dei coni. Un’alterata attività di GNAT2 è associata a fenotipi ereditari di disfunzione retinica, rendendolo rilevante per studi sulla segnalazione specifica dei coni e sulla biologia dei neuroni sensoriali.

Gα t2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GNAT2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gα t2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GNAT2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GNAT2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gα t2 . A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GNAT2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gα t2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gα t2 nelle cellule tumorali con espressione di GNAT2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.