G_{α 15} Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403266-ACT

GNA15 codifica la subunità alfa Gα15 delle proteine G eterotrimeriche, un membro della famiglia Gq che accoppia diversi recettori accoppiati a proteine G (GPCR) all’attivazione della fosfolipasi C-β. Questo asse di segnalazione promuove la produzione di inositolo trifosfato e diacilglicerolo, la mobilizzazione del calcio e programmi trascrizionali dipendenti dalla protein chinasi C che modellano l’attivazione delle cellule immunitarie ed ematopoietiche. Gα15 è arricchita nelle linee leucocitarie e può ampliare la specificità di accoppiamento dei recettori, influenzando chemiotassi, rilascio di citochine ed espressione genica responsiva allo stress. Una segnalazione GPCR–Gα15 deregolata è stata implicata in un’anomala segnalazione infiammatoria e in un’alterata attività dei fattori di crescita e della via MAPK in contesti cellulari rilevanti per la patologia.

Gα 15 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GNA15 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gα 15 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GNA15 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GNA15, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gα 15. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GNA15 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gα 15 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gα 15 nelle cellule tumorali con espressione di GNA15 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.