GS28 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404357-ACT

Il gene umano **GOSR1** codifica GS28, membro del complesso recettoriale SNAP del Golgi, una SNARE del traffico vescicolare che supporta il trasporto retrogrado dipendente da COPI e la fusione di membrane all’interno del Golgi. Coordinando le dinamiche ER–Golgi e quelle delle cisterne del Golgi, GS28 contribuisce a mantenere l’architettura del Golgi, la capacità di glicosilazione e un corretto smistamento del carico lungo la via secretoria. L’alterazione del trasporto mediato da SNARE è associata a risposte di stress cellulare, a una proteostasi modificata e a programmi di traffico deregolati, frequentemente studiati nella neurodegenerazione, nella biologia delle infezioni e nei fenotipi secretori delle cellule tumorali. In quanto componente centrale della macchina di fusione di membrana, GS28 rappresenta un nodo sperimentalmente accessibile per analizzare come il trasporto nel Golgi influenzi la segnalazione, l’omeostasi degli organelli e la maturazione delle proteine.

GS28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GOSR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GS28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GOSR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GOSR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GS28. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GOSR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GS28 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GS28 nelle cellule tumorali con espressione di GOSR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.