granzyme B Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420745-ACT

Il gene murino **Gzmb** codifica la granzima B, una proteasi serinica citotossica immagazzinata nei granuli litici dei linfociti T CD8+ attivati e delle cellule NK. Dopo la formazione della sinapsi immunologica e il rilascio facilitato dalla perforina, la granzima B avvia la morte cellulare programmata clivando le caspasi e BID, amplificando le vie apoptotiche mitocondriali e quelle dipendenti dalle caspasi. Questa funzione effettrice è fondamentale per la sorveglianza immunitaria antivirale e antitumorale, mentre un’attività deregolata è associata a immunopatologia durante l’infiammazione cronica e al danno tissutale autoimmune. Le dinamiche di espressione di **Gzmb** vengono inoltre utilizzate come indicatore dello stato di attivazione dei linfociti citotossici e della loro differenziazione effettrice nei modelli di immunologia.

granzyme B Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Gzmb senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

granzyme B Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Gzmb nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Gzmb, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di granzyme B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Gzmb nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da granzyme B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via granzyme B nelle cellule tumorali con espressione di Gzmb silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.