granzyme B CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420745-ACT

Das Mausgen **Gzmb** kodiert für **Granzyme B**, eine zytotoxische Serinprotease, die in lytischen Granula aktivierter **CD8+ T-Zellen** und **NK-Zellen** gespeichert wird. Nach der Bildung einer immunologischen Synapse und der perforinvermittelten Einschleusung initiiert Granzyme B den programmierten Zelltod, indem es **Caspasen** und **BID** spaltet und dadurch mitochondriale sowie caspaseabhängige apoptotische Signalwege verstärkt. Diese Effektorfunktion ist zentral für die antivirale und antitumorale Immunüberwachung, während eine fehlregulierte Aktivität mit Immunpathologie bei chronischer Entzündung und autoimmuner Gewebeschädigung in Verbindung gebracht wird. Die Expressionsdynamik von **Gzmb** dient zudem in immunologischen Modellen als Readout für den Aktivierungszustand zytotoxischer Lymphozyten und deren Effektor-Differenzierung.

granzyme B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Gzmb-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

granzyme B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Gzmb-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Gzmb-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen granzyme B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Gzmb-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von granzyme B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des granzyme B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Gzmb-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.