granzyme B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401469-ACT

Il gene umano **GZMB** codifica la granzima B, una proteasi serinica di tipo tripsina immagazzinata nei granuli citotossici dei linfociti T CD8+ e delle cellule NK, che media l’uccisione delle cellule bersaglio dopo il rilascio dipendente dalla perforina. La granzima B scinde substrati chiave per attivare l’apoptosi caspasi-dipendente e può anche innescare vie di morte caspasi-indipendenti attraverso alterazioni mitocondriali, collegandosi così ai programmi effettori immunitari a valle del riconoscimento dell’antigene e della segnalazione infiammatoria. Una deregolazione dell’espressione e dell’attività di GZMB è stata associata a danno tissutale e rimodellamento mediati dal sistema immunitario nell’infiammazione cronica e nell’autoimmunità, nonché a una sorveglianza citotossica alterata in contesti di cancro e infezioni virali. Di conseguenza, GZMB è ampiamente utilizzato come marcatore funzionale dell’attivazione dei linfociti citotossici e come nodo meccanicistico per lo studio dell’apoptosi, della biologia della sinapsi immunologica e dell’immunopatologia.

granzyme B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GZMB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

granzyme B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GZMB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GZMB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di granzyme B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GZMB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da granzyme B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via granzyme B nelle cellule tumorali con espressione di GZMB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.