granzyme A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403958-ACT

Il gene umano **GZMA** codifica la granzima A, una proteasi serinica di tipo tripsina (triptasi) immagazzinata nei granuli dei linfociti citotossici e rilasciata durante l’ingaggio della sinapsi immunologica per promuovere il danno della cellula bersaglio e la segnalazione infiammatoria. La granzima A contribuisce a meccanismi citotossici indipendenti dalle caspasi e può modulare vie associate alle risposte al danno del DNA, alla disfunzione mitocondriale e alla produzione di citochine nelle cellule colpite. La sua espressione e attività sono studiate nel contesto della sorveglianza immunitaria antivirale e antitumorale, così come dei programmi citotossici disregolati associati ad autoimmunità e infiammazione cronica. Poiché **GZMA** è un marcatore di linfociti T citotossici e cellule NK attivati, viene spesso utilizzato per analizzare le transizioni di stato delle cellule immunitarie, la funzione effettrice e le dinamiche immunitarie del microambiente.

granzyme A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GZMA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

granzyme A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GZMA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GZMA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di granzyme A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GZMA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da granzyme A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via granzyme A nelle cellule tumorali con espressione di GZMA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.