GP-39 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402147-ACT

CHI3L1 codifica la glicoproteina GP-39 (YKL-40), una proteina secreta di tipo “chitinase-like” priva di attività chitinasi enzimatica, ma in grado di modulare il rimodellamento della matrice extracellulare, l’adesione cellulare e la segnalazione infiammatoria. GP-39 è prodotta da macrofagi, neutrofili, fibroblasti e da molteplici compartimenti stromali ed epiteliali, e influenza la chemiotassi, i programmi angiogenici e le risposte di riparazione tissutale. È comunemente studiata in vie legate all’attivazione dell’immunità innata, alle reti citochiniche e al rimodellamento fibrotico, incluse le risposte trascrizionali associate a MAPK/ERK, PI3K/AKT e NF-κB. Un’espressione alterata di CHI3L1/GP-39 è associata a infiammazione cronica, fibrosi e biologia del microambiente tumorale, rendendola rilevante per studi meccanicistici sul crosstalk immuno–stromale e sulla dinamica della matrice extracellulare.

GP-39 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHI3L1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GP-39 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHI3L1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHI3L1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GP-39. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHI3L1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GP-39 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GP-39 nelle cellule tumorali con espressione di CHI3L1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.