GLI-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400853-ACT

GLI3 codifica il fattore di trascrizione GLI-3 con dita di zinco, un effettore centrale e, in funzione del contesto, repressore/attivatore della via di segnalazione Hedgehog (HH). Attraverso un processamento proteolitico regolato e il controllo trascrizionale nel nucleo, GLI-3 integra i segnali provenienti dalle ciglia primarie e modula programmi di sviluppo che governano la definizione dei pattern, il comportamento delle cellule staminali/progenitrici e la morfogenesi dei tessuti. Un’attività deregolata di GLI3 altera le reti di espressione dei geni bersaglio di HH ed è stata associata a sindromi congenite da malformazione e a fenotipi oncogeni guidati dalla via, in cui risulta modificato l’output trascrizionale HH–GLI. In quanto nodo trascrizionale a valle di PTCH1/SMO, GLI-3 è ampiamente utilizzato per studiare la dinamica della via HH, la segnalazione ciliare e la regolazione trascrizionale in modelli cellulari umani.

GLI-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GLI3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GLI-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GLI3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GLI3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GLI-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GLI3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GLI-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GLI-3 nelle cellule tumorali con espressione di GLI3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.