GLI-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400839-ACT

GLI2 codifica per GLI-2, un fattore di trascrizione a dita di zinco che funge da principale effettore nucleare della segnalazione Hedgehog a valle di PTCH1 e SMO. Legandosi agli elementi consenso GLI, GLI-2 regola programmi trascrizionali che controllano il patterning embrionale, le decisioni di destino cellulare, il mantenimento di cellule staminali/progenitrici e, in modo dipendente dal contesto, proliferazione e differenziamento. L’attività di GLI2 è modulata da processamento proteolitico, fosforilazione e interazioni con SUFU e altri cofattori, integrando il crosstalk con vie quali TGF-β, WNT e PI3K/AKT. Un’espressione o attivazione deregolata di GLI2 è associata ad anomalie dello sviluppo ed è frequentemente implicata in stati trascrizionali oncogenici in molteplici contesti tumorali, a supporto del suo impiego in studi di via di segnalazione e di meccanismi di malattia.

GLI-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GLI2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GLI-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GLI2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GLI2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GLI-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GLI2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GLI-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GLI-2 nelle cellule tumorali con espressione di GLI2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.