FGF-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403042-ACT

FGF4 codifica il fattore di crescita dei fibroblasti 4 (FGF-4), un ligando mitogeno secreto che segnala principalmente attraverso le tirosin-chinasi dei recettori FGFR per regolare la strutturazione dell’embrione, l’induzione del mesoderma e la crescita dei tessuti. Il legame di FGF-4 attiva le cascate canoniche MAPK/ERK e PI3K/AKT e può influenzare, in modo dipendente dal contesto, la progressione del ciclo cellulare, la sopravvivenza e i programmi di differenziamento. Una deregolazione della segnalazione FGF4/FGFR è stata implicata in fenotipi proliferativi e di sviluppo aberranti ed è studiata in modelli di attivazione di vie oncogeniche e di alterata specificazione di linea. Nelle cellule umane, FGF-4 rappresenta un nodo sperimentale maneggevole per analizzare le risposte trascrizionali guidate dai fattori di crescita, il crosstalk tra recettori e la dinamica delle vie chinasi a valle.

FGF-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FGF4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FGF-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FGF4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FGF4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FGF-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FGF4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FGF-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FGF-4 nelle cellule tumorali con espressione di FGF4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.