Factor B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402091-ACT

Il gene del fattore B del complemento (CFB) codifica il Fattore B, uno zimogeno di serina proteasi centrale della via alternativa del complemento che si associa a C3b per formare la proconvertasi e, dopo il clivaggio da parte del Fattore D, la convertasi di C3 (C3bBb). Questo complesso enzimatico amplifica l’attivazione del complemento, favorendo l’opsonizzazione, la segnalazione infiammatoria mediata dalle anafilotossine e, a valle, la formazione del complesso di attacco alla membrana. L’attività del Fattore B è strettamente regolata da inibitori del complemento per bilanciare la difesa dell’ospite con la prevenzione di danni collaterali ai tessuti. Un’attivazione disregolata della via alternativa e le varianti genetiche in CFB sono associate a condizioni infiammatorie e degenerative guidate dal complemento, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico nella ricerca sull’immunità innata.

Factor B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CFB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Factor B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CFB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CFB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Factor B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CFB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Factor B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Factor B nelle cellule tumorali con espressione di CFB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.