ERK 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400043-ACT

MAPK1 codifica la chinasi 2 regolata da segnali extracellulari (ERK2), una chinasi serina/treonina che funge da effettore centrale della cascata MAPK RAS–RAF–MEK–ERK. ERK2 integra segnali provenienti da fattori di crescita e citochine per regolare programmi trascrizionali che controllano proliferazione, differenziamento, sopravvivenza e risposte allo stress, attraverso la fosforilazione di substrati citosolici e nucleari. Questa via coordina inoltre la progressione del ciclo cellulare e la regolazione a feedback della segnalazione a monte, modellando ampiezza e durata del segnale. Una segnalazione ERK deregolata è ampiamente implicata nella trasformazione oncogenica e in processi di sviluppo e infiammatori alterati, rendendo MAPK1/ERK2 un nodo chiave per studi meccanicistici sulle dinamiche di segnalazione e sul cross-talk tra vie.

ERK 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAPK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ERK 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAPK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAPK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ERK 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAPK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ERK 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ERK 2 nelle cellule tumorali con espressione di MAPK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.