EKLF/KLF1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402366-ACT

KLF1 (fattore Krüppel-like eritroide; EKLF) è un fattore di trascrizione a espressione ristretta alla linea eritroide che coordina l’eritropoiesi controllando programmi di espressione genica specifici di stadio nei progenitori eritroidi. Si lega agli elementi CACCC e coopera con i principali regolatori eritroidi per promuovere lo switching dell’emoglobina, la maturazione della membrana e del citoscheletro e il rimodellamento metabolico eritroide, integrandosi con le reti trascrizionali guidate da GATA1/TAL1. KLF1 influenza anche lo stato della cromatina tramite il reclutamento di co-regolatori, modulando l’attività degli enhancer e le traiettorie di differenziamento eritroide. La deregolazione o le mutazioni di KLF1 sono associate a fenotipi ereditari dei globuli rossi, inclusi un’alterata espressione delle globine e caratteristiche legate all’anemia, rendendolo un nodo chiave per lo studio della regolazione genica eritroide e dei meccanismi delle malattie ematologiche.

EKLF/KLF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KLF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EKLF/KLF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KLF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KLF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EKLF/KLF1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KLF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EKLF/KLF1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EKLF/KLF1 nelle cellule tumorali con espressione di KLF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.