eIF4AIII Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402660-ACT

EIF4A3 codifica eIF4AIII, un’elicasi dell’RNA della famiglia DEAD-box che funge da componente centrale del complesso di giunzione degli esoni (exon junction complex, EJC) depositato sugli mRNA dopo lo splicing. eIF4AIII coordina la regolazione genica post-trascrizionale collegando lo splicing del pre-mRNA all’esportazione dell’mRNA, alla sua localizzazione, al controllo della traduzione e alla degradazione dell’mRNA mediata da codoni di stop prematuri (NMD), contribuendo così alla fedeltà del trascrittoma e alla proteostasi. Attraverso i suoi ruoli nella sorveglianza dell’RNA e nel controllo di qualità dipendente dallo splicing, EIF4A3 influenza vie legate alla progressione del ciclo cellulare, al mantenimento del genoma e alle risposte allo stress. La deregolazione dell’attività dell’EJC e della NMD è stata associata a un uso aberrante delle isoforme e a un’alterata espressione di reti geniche oncogeniche e neuroevolutive, rendendo EIF4A3 un nodo rilevante per studi meccanicistici dei difetti di processamento dell’RNA.

eIF4AIII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EIF4A3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

eIF4AIII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EIF4A3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EIF4A3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di eIF4AIII. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EIF4A3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da eIF4AIII nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via eIF4AIII nelle cellule tumorali con espressione di EIF4A3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.