eIF2C4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401658-ACT

AGO4, noto anche come eIF2C4, codifica Argonaute-4, un membro della famiglia di proteine Argonaute che lega piccoli RNA per guidare la regolazione dell’espressione genica in modo specifico per sequenza. Attraverso processi associati al complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC), AGO4 contribuisce a meccanismi di controllo post-trascrizionale che modulano la stabilità dell’mRNA e la traduzione nel citoplasma. La regolazione dell’RNA dipendente da Argonaute influenza vie che governano l’identità cellulare, la differenziazione e le risposte allo stress, e le reti di piccoli RNA alterate sono spesso studiate nel contesto della segnalazione oncogenica e della regolazione immunitaria. La disregolazione del controllo genico mediato da Argonaute è stata collegata, in ambito di ricerca, a un rimodellamento anomalo del trascrittoma osservato in molteplici fenotipi cellulari rilevanti per diverse patologie.

eIF2C4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AGO4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

eIF2C4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AGO4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AGO4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di eIF2C4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AGO4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da eIF2C4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via eIF2C4 nelle cellule tumorali con espressione di AGO4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.