eIF2α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400199-ACT

EIF2S1 codifica la subunità alfa del fattore eucariotico umano di inizio della traduzione 2 (eIF2α), un regolatore centrale dell’avvio della traduzione dell’mRNA e della proteostasi. La fosforilazione di eIF2α in Ser51 integra segnali della risposta integrata allo stress (ISR) tramite chinasi tra cui PERK, GCN2, PKR e HRI, riducendo la sintesi proteica globale e al contempo favorendo programmi di traduzione selettiva come ATF4. Attraverso questo meccanismo, EIF2S1 collega stress del RE, deprivazione di nutrienti, rilevamento dei virus e stress ossidativo a un rimodellamento adattativo trascrizionale e metabolico. Una segnalazione di eIF2α deregolata è stata implicata in diversi contesti, quali neurodegenerazione, tolleranza allo stress nelle cellule tumorali e fisiopatologia infiammatoria, rendendo la modulazione di EIF2S1 utile per la dissezione delle vie di segnalazione.

eIF2α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EIF2S1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

eIF2α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EIF2S1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EIF2S1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di eIF2α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EIF2S1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da eIF2α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via eIF2α nelle cellule tumorali con espressione di EIF2S1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.