EHHADH Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404068-ACT

EHHADH (enoil-CoA idratasi e 3-idrossiacil-CoA deidrogenasi) codifica un enzima perossisomiale bifunzionale che catalizza fasi consecutive della β‑ossidazione perossisomiale degli acidi grassi, supportando l’accorciamento della catena di acil‑CoA di acidi grassi a catena molto lunga e a catena ramificata. Grazie al suo ruolo nel catabolismo lipidico e nell’equilibrio redox, EHHADH contribuisce al crosstalk metabolico tra perossisomi e mitocondri e alla regolazione dell’omeostasi energetica cellulare. Un’alterata espressione o attività di EHHADH è stata associata a fenotipi di disfunzione perossisomiale e a processi rilevanti per le malattie metaboliche, inclusi accumulo lipidico, stress ossidativo e adattamento metabolico epatico. EHHADH rappresenta quindi un bersaglio utile per studiare il metabolismo lipidico guidato dai perossisomi, l’omeostasi degli organelli e i programmi trascrizionali legati allo stress metabolico.

EHHADH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EHHADH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EHHADH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EHHADH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EHHADH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EHHADH. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EHHADH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EHHADH nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EHHADH nelle cellule tumorali con espressione di EHHADH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.