Egr-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403343-ACT

EGR4 codifica Egr-4, un fattore di trascrizione “immediate-early” a dita di zinco che collega segnali extracellulari a rapidi cambiamenti nei programmi di espressione genica. Viene indotto a valle di MAPK/ERK e di altre cascate di segnalazione dipendenti dall’attività, dove modula reti trascrizionali coinvolte nelle decisioni sul destino cellulare, nella differenziazione e in risposte allo stress specifiche del contesto. Egr-4 partecipa a circuiti regolatori che controllano la biologia del sistema nervoso e dell’apparato riproduttivo, e pattern di espressione alterati sono stati riportati in studi sulla biologia dei tumori e sui processi di neurosviluppo. In quanto regolatore trascrizionale, EGR4 rappresenta un nodo utile per interrogare reti geniche sensibili agli stimoli e il rimodellamento delle vie di segnalazione a valle.

Egr-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EGR4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Egr-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EGR4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EGR4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Egr-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EGR4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Egr-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Egr-4 nelle cellule tumorali con espressione di EGR4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.