EAAT3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401539-ACT

SLC1A1 codifica il trasportatore 3 degli amminoacidi eccitatori (EAAT3), un trasportatore di glutammato e aspartato ad alta affinità, dipendente dal sodio, che contribuisce a regolare i livelli extracellulari di amminoacidi eccitatori e a sostenere la disponibilità intracellulare di glutammato per il metabolismo e l’equilibrio redox. L’attività di EAAT3 partecipa alla rimozione dei neurotrasmettitori, all’omeostasi della segnalazione sinaptica e alla vulnerabilità neuronale allo stress ossidativo attraverso vie dipendenti dal glutammato che si intrecciano con l’assorbimento di cisteina e la sintesi di glutatione. Nei tessuti umani, SLC1A1 è associato a processi di trasporto neuronali ed epiteliali ed è stato studiato nel contesto di alterazioni della neurotrasmissione eccitatoria e delle risposte cellulari allo stress. Modifiche genetiche e di espressione di SLC1A1 sono state correlate a fenotipi neuropsichiatrici e del neurosviluppo, motivando studi meccanicistici sulla regolazione del trasportatore e sulla segnalazione a valle.

EAAT3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC1A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EAAT3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC1A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC1A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EAAT3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC1A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EAAT3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EAAT3 nelle cellule tumorali con espressione di SLC1A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.