Dynamin II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401037-ACT

DNM2 codifica la dinamina II umana, una grande GTPasi che catalizza la scissione di membrana durante l’endocitosi mediata da clatrina e altri eventi di traffico vescicolare. La dinamina II si coordina con il rimodellamento dell’actina, le proteine con dominio BAR e i complessi adattatori per regolare l’internalizzazione dei recettori, il riciclo delle vescicole sinaptiche e lo smistamento endosomiale, contribuendo così a definire gli output di segnalazione e l’omeostasi di membrana. Attraverso i suoi ruoli nella dinamica delle membrane, DNM2 influenza processi quali la citocinesi e la distribuzione degli organelli, collegando il controllo endocitico alla fisiologia cellulare più ampia. Alterazioni dell’attività o della regolazione di DNM2 sono associate a fenotipi neuromuscolari e di neurosviluppo e vengono spesso studiate per il loro impatto sul traffico dei recettori e sulla modulazione delle vie a valle.

Dynamin II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DNM2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dynamin II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DNM2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DNM2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dynamin II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DNM2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dynamin II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dynamin II nelle cellule tumorali con espressione di DNM2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.