DUSP27 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404063-ACT

DUPD1 codifica il membro della famiglia delle fosfatasi a duplice specificità DUSP27, una proteina coinvolta nella regolazione della segnalazione dipendente dalla fosforilazione attraverso la modulazione di residui di serina/treonina e tirosina sulle proteine bersaglio. L’attività associata a DUSP27 è collegata al controllo di vie guidate da chinasi che coordinano la differenziazione cellulare, l’organizzazione del citoscheletro e programmi di segnalazione in risposta allo stress. Nei tessuti umani, l’espressione di DUSP27 è stata studiata nel contesto dello sviluppo e del rimodellamento muscolare, in cui un’alterazione dell’equilibrio fosfatasi/chinasi può influenzare la funzione contrattile e le transizioni dello stato cellulare. Una deregolazione della segnalazione della famiglia DUSP è ampiamente rilevante per patologie caratterizzate da attività anomala di vie correlate alle MAPK e da un’omeostasi della fosforilazione alterata, a supporto dell’uso di modelli di perturbazione di DUSP27 per studi meccanicistici.

DUSP27 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DUPD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DUSP27 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DUPD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DUPD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DUSP27. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DUPD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DUSP27 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DUSP27 nelle cellule tumorali con espressione di DUPD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.