Dnmt1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-420033-LAC

Il gene murino Dnmt1 codifica la DNA metiltransferasi 1 (DNMT1), la principale metiltransferasi di mantenimento, che durante la fase S copia i pattern di metilazione dei CpG sul DNA neosintetizzato per preservare la memoria epigenetica dopo la replicazione. DNMT1 coordina la propria attività con UHRF1, PCNA e fattori associati alla cromatina per accoppiare il mantenimento della metilazione del DNA con la replicazione del DNA, il rimodellamento della cromatina, la repressione trascrizionale e la stabilità del genoma. Tramite la regolazione della metilazione di promotori ed elementi ripetitivi, DNMT1 influenza l’impegno di linea, l’imprinting, l’inattivazione del cromosoma X e la soppressione degli elementi trasponibili. Un’attività o un’espressione deregolata di DNMT1 è associata a paesaggi aberranti di metilazione del DNA osservati in oncologia, in difetti dello sviluppo e in modelli di instabilità epigenetica, a supporto del suo impiego in studi sulla regolazione genica e sulle transizioni degli stati della cromatina.

Le particelle di attivazione lentivirale Dnmt1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Dnmt1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Dnmt1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Dnmt1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Dnmt1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Dnmt1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.