DND1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404161-ACT

La DND1 umana (dead end protein homolog 1) è una proteina legante l’RNA che regola l’espressione genica post-trascrizionale riconoscendo specifici motivi di sequenza negli mRNA bersaglio e modulandone stabilità e traduzione. È nota soprattutto per i suoi ruoli nello sviluppo delle cellule germinali e nel mantenimento dell’identità cellulare, inclusa la coordinazione delle decisioni sul destino degli RNA che influenzano programmi di proliferazione, differenziamento e sopravvivenza. DND1 partecipa a reti che si intersecano con la regolazione mediata dai microRNA, limitando l’accesso dei microRNA a trascritti selezionati e quindi plasmando i profili proteomici durante lo sviluppo. La disregolazione del controllo dell’RNA dipendente da DND1 è stata associata, in sistemi modello, ad alterazioni della biologia della linea germinale e a fenotipi correlati ai tumori, rendendola rilevante per studi su riprogrammazione oncogenica, transizioni di destino cellulare e circuiti di regolazione dell’RNA.

DND1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DND1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DND1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DND1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DND1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DND1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DND1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DND1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DND1 nelle cellule tumorali con espressione di DND1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.