DMRT1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424507-ACT

Dmrt1 codifica DMRT1, un fattore di trascrizione del dominio DM evolutivamente conservato, necessario per la determinazione del sesso maschile e la differenziazione postnatale del testicolo nel topo. DMRT1 regola programmi di espressione genica nelle cellule del Sertoli e nelle cellule germinali che mantengono il destino degli spermatogoni, limitano l’ingresso meiotico inappropriato e preservano l’identità testicolare attraverso un controllo trascrizionale specifico di stadio. Interagisce con reti di segnalazione dello sviluppo e con la regolazione mediata dalla cromatina, che coordinano la patterning gonadica, la progressione del ciclo cellulare e l’impegno di linea. L’alterazione o la disregolazione di Dmrt1 è associata a disturbi dello sviluppo sessuale e a una spermatogenesi compromessa, rendendolo un bersaglio chiave per lo studio della biologia riproduttiva e delle vie correlate ai tumori gonadici in modelli sperimentali.

DMRT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Dmrt1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DMRT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Dmrt1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Dmrt1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DMRT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Dmrt1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DMRT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DMRT1 nelle cellule tumorali con espressione di Dmrt1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.