DGK-ε Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404387-ACT

DGKE codifica la diacilglicerolo chinasi epsilon (DGK-ε), una chinasi lipidica che fosforila il diacilglicerolo generando acido fosfatidico, modulando la segnalazione dei secondi messaggeri e la composizione lipidica delle membrane. DGK-ε mostra selettività di substrato per il diacilglicerolo contenente arachidonoile, collegandola al ciclo dei fosfoinositidi e alla regolazione delle cascate di segnalazione dipendenti dalla PKC. Attraverso il controllo dell’equilibrio DAG/PA, DGK-ε influenza processi tra cui la trasduzione del segnale a livello delle membrane, le risposte cellulari allo stress e la segnalazione infiammatoria. Alterazioni dell’attività di DGKE sono state associate alla microangiopatia trombotica e a patologie renali, a supporto della sua rilevanza per studi meccanicistici della biologia vascolare e renale.

DGK-ε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DGKE senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DGK-ε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DGKE nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DGKE, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DGK-ε. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DGKE nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DGK-ε nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DGK-ε nelle cellule tumorali con espressione di DGKE silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.