DAP-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410955-ACT

THAP12 codifica una proteina legante il DNA contenente un dominio THAP, coinvolta nella regolazione trascrizionale e nel controllo dell’espressione genica associato alla cromatina. In quanto DAP-4, ci si attende che influenzi la regolazione in prossimità del promotore e i programmi a valle legati alla progressione del ciclo cellulare, alla differenziazione e alla segnalazione responsiva allo stress. Le proteine della famiglia THAP interagiscono comunemente con il macchinario epigenetico e con elementi di DNA a sequenza specifica, modulando gli output a livello di via attraverso meccanismi di attivazione o repressione dipendenti dal contesto. La deregolazione dei regolatori trascrizionali con dominio THAP è stata associata ad alterazioni della capacità proliferativa e a squilibri nella regolazione genomica, rendendo THAP12 rilevante per studi meccanicistici degli stati trascrizionali associati a malattia nelle cellule umane.

DAP-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di THAP12 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DAP-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus THAP12 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione THAP12, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DAP-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus THAP12 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DAP-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DAP-4 nelle cellule tumorali con espressione di THAP12 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.