Cytokeratin 16 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403138-ACT

KRT16 codifica la citocheratina 16, una proteina dei filamenti intermedi di tipo I che forma eterodimeri con i membri della famiglia delle cheratine 6 per rinforzare la rete del citoscheletro negli epiteli stratificati. Viene indotta rapidamente durante la riparazione delle ferite, in risposta a stress meccanico e a segnali infiammatori, sostenendo la proliferazione e la migrazione dei cheratinociti e il rimodellamento della barriera. La citocheratina 16 partecipa all’organizzazione dei filamenti di cheratina e ai programmi di differenziazione epiteliale che interagiscono con le vie di risposta allo stress e con la dinamica del citoscheletro. Un’espressione deregolata di KRT16 è associata a stati cutanei iperproliferativi e a disturbi della cheratinizzazione, rendendola un marcatore utile e un nodo funzionale per lo studio dell’omeostasi epidermica e delle risposte epiteliali allo stress.

Cytokeratin 16 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KRT16 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cytokeratin 16 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KRT16 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KRT16, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cytokeratin 16. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KRT16 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cytokeratin 16 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cytokeratin 16 nelle cellule tumorali con espressione di KRT16 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.