CYP46 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419926-ACT

Il gene murino **Cyp46a1** codifica la colesterolo 24-idrossilasi (CYP46A1/CYP46), un enzima del citocromo P450 arricchito nel cervello che catalizza la conversione del colesterolo in 24S-idrossicolesterolo, sostenendo il turnover del colesterolo e il suo efflusso attraverso la barriera emato-encefalica. Questa reazione collega l’omeostasi degli steroli neuronali a reti metaboliche lipidiche più ampie, inclusi la segnalazione mediata dagli ossisteroli e la regolazione della composizione delle membrane dipendente dal colesterolo, che influenza la funzione sinaptica. Un’alterata attività di CYP46A1 è associata a perturbazioni dell’equilibrio del colesterolo nel cervello ed è stata studiata nel contesto di fenotipi neurodegenerativi e cognitivi, in cui la disregolazione degli steroli si intreccia con vie di neuroinfiammazione e proteostasi.

CYP46 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cyp46a1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CYP46 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cyp46a1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cyp46a1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CYP46. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cyp46a1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CYP46 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CYP46 nelle cellule tumorali con espressione di Cyp46a1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.