CYP2W1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404238-ACT

Il gene umano **CYP2W1** codifica una monoossigenasi del citocromo P450 che catalizza il metabolismo ossidativo di diversi substrati endogeni e xenobiotici, contribuendo all’equilibrio redox cellulare e alle reazioni di bioattivazione/detossificazione. In quanto enzima eme associato al reticolo endoplasmatico (RE), CYP2W1 partecipa ai processi metabolici di fase I che si intrecciano con l’ossidazione dei lipidi, la gestione delle specie reattive dell’ossigeno e le vie di coniugazione a valle. La sua espressione è in genere bassa nella maggior parte dei tessuti adulti, ma è stata riportata come elevata in alcuni contesti tumorali, rendendolo rilevante per lo studio della riprogrammazione metabolica associata al cancro e di programmi atipici di espressione dei P450. L’attività e la regolazione di CYP2W1 sono quindi utili per indagare la segnalazione di risposta agli xenobiotici, le vulnerabilità metaboliche e le interazioni gene–ambiente in modelli cellulari umani.

CYP2W1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CYP2W1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CYP2W1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CYP2W1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CYP2W1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CYP2W1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CYP2W1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CYP2W1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CYP2W1 nelle cellule tumorali con espressione di CYP2W1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.