COPA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404020-ACT

COPA codifica la subunità alfa del complesso coatomerico I (COPI), un mediatore fondamentale del traffico vescicolare tra l’apparato di Golgi e il reticolo endoplasmatico e all’interno delle cisterne del Golgi. Supportando il trasporto retrogrado e lo smistamento del carico, COPA contribuisce al mantenimento dell’omeostasi degli organelli, alla processazione delle proteine e all’integrità della via secretoria. Il traffico dipendente da COPA si interfaccia con le risposte cellulari allo stress, inclusi lo stress del RE e la segnalazione della risposta alle proteine non correttamente ripiegate (UPR), e influenza la segnalazione immunitaria e infiammatoria attraverso effetti sulla localizzazione delle proteine. Alterazioni genetiche di COPA sono state associate a disregolazione immunitaria e a fenotipi di malattia infiammatoria, rendendolo un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sul trasporto intracellulare e sull’immunobiologia.

COPA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COPA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

COPA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COPA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COPA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di COPA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COPA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da COPA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via COPA nelle cellule tumorali con espressione di COPA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.