CDKN3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403243-ACT

CDKN3 (inibitore 3 delle chinasi ciclina-dipendenti) codifica una fosfatasi a doppia specificità che modula la progressione del ciclo cellulare defosforilando le chinasi ciclina-dipendenti, con ruoli di rilievo nel controllo dell’attività di CDK1/CDC2 nella transizione G2/M. Attraverso la regolazione di checkpoint dipendenti dalla fosforilazione, CDKN3 influenza l’ingresso in mitosi, il tasso di proliferazione e i programmi di stabilità genomica legati alle risposte al danno al DNA. Un’espressione deregolata di CDKN3 è stata associata a un controllo alterato del ciclo cellulare in diversi contesti oncologici, rendendolo un nodo molecolare utile per studiare la segnalazione proliferativa e l’adattamento dei checkpoint. Nelle cellule umane, la perturbazione dei livelli di CDKN3 può aiutare a chiarire come la modulazione delle CDK mediata da fosfatasi plasmi la fedeltà mitotica e gli stati trascrizionali responsivi allo stress.

CDKN3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDKN3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CDKN3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDKN3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDKN3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CDKN3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDKN3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CDKN3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CDKN3 nelle cellule tumorali con espressione di CDKN3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.