CDC42 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418353-ACT

CDC42 codifica una piccola GTPasi della famiglia Rho, espressa in modo ubiquitario, che funge da interruttore molecolare controllando il rimodellamento del citoscheletro di actina, la polarità cellulare, il traffico vescicolare e la progressione del ciclo cellulare. Alternando gli stati legati a GDP e a GTP, CDC42 coordina la segnalazione attraverso effettori quali PAK, WASP/N-WASP e il complesso di polarità PAR, collegando segnali recettoriali alla dinamica del citoscheletro e a programmi trascrizionali. L’attività di CDC42 interseca vie tra cui PI3K–AKT, MAPK e l’adesione mediata dalle integrine per regolare migrazione, endocitosi e integrità delle giunzioni. Una segnalazione deregolata di CDC42 è stata associata ad alterazioni della funzione delle cellule immunitarie, anomalie del neurosviluppo e fenotipi oncogeni caratterizzati da motilità e invasione aberranti.

CDC42 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDC42 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CDC42 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDC42 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDC42, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CDC42. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDC42 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CDC42 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CDC42 nelle cellule tumorali con espressione di CDC42 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.