CD35 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401210-ACT

Il recettore del complemento 1 (CR1), noto anche come CD35, è una glicoproteina di superficie cellulare espressa su eritrociti, leucociti e cellule dendritiche follicolari, che lega le opsonine del complemento C3b e C4b per promuovere la rimozione dei complessi immuni e regolare l’amplificazione della cascata del complemento. Accelerando la dissociazione delle convertasi C3/C5 e agendo da cofattore per la scissione di C3b/C4b mediata dal fattore I, CD35 modella la segnalazione dell’immunità innata, la fagocitosi e la gestione dell’antigene durante le risposte infiammatorie. La funzione di CR1 interseca le vie del complemento classica e alternativa, influenzando la difesa dell’ospite, il traffico dei complessi immuni e il crosstalk con i processi mediati dai recettori Fc. Variazioni genetiche e di espressione di CR1 sono state associate a una suscettibilità e a una patobiologia alterate nell’infiammazione guidata da complessi immuni e in fenotipi neuroinfiammatori ed ematologici legati al complemento, a supporto della sua utilità come bersaglio di ricerca meccanicistica.

CD35 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD35 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD35. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD35 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD35 nelle cellule tumorali con espressione di CR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.