CD14 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400344-ACT

Il CD14 umano codifica un co-recettore ancorato al glicosilfosfatidilinositolo (GPI), espresso prevalentemente su monociti, macrofagi e neutrofili, che potenzia il riconoscimento innato del lipopolisaccaride batterico e di altri ligandi associati ai patogeni. CD14 coopera con TLR4–MD-2 e LBP per promuovere la segnalazione dipendente da MyD88 e TRIF, attivando programmi trascrizionali infiammatori mediati da NF-κB e IRF e la produzione di citochine. In quanto regolatore del riconoscimento delle endotossine e degli stati di attivazione mieloide, le alterazioni dell’espressione di CD14 e delle dinamiche di segnalazione vengono frequentemente studiate nel contesto della biologia delle infezioni, dei disturbi infiammatori cronici e della disregolazione immunitaria. CD14 è inoltre utilizzato come marcatore e modulatore funzionale nelle analisi della differenziazione dei monociti in macrofagi, della polarizzazione e delle risposte al microambiente.

CD14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CD14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CD14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CD14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD14. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CD14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD14 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD14 nelle cellule tumorali con espressione di CD14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.