cathepsin B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400360-ACT

CTSB codifica la proteasi cisteinica lisosomiale catepsina B, un mediatore chiave del turnover proteico intracellulare e del rimodellamento endolisosomiale. La catepsina B partecipa al catabolismo dipendente dai lisosomi, al crosstalk tra autofagia e lisosomi e al processamento regolato delle proteine all’interno dei compartimenti endocitici, con ruoli aggiuntivi nel turnover della matrice extracellulare quando viene secreta o ridistribuita. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di CTSB sono state collegate a cambiamenti nel processamento dell’antigene, nelle risposte associate all’inflammasoma e nelle vie di stress della proteostasi che influenzano la sopravvivenza cellulare e il rimodellamento tissutale. La disregolazione della catepsina B è spesso studiata nel contesto dell’invasione e metastatizzazione tumorale, della neurodegenerazione e dei disturbi infiammatori, dove variazioni della funzione lisosomiale e dell’equilibrio delle proteasi contribuiscono a fenotipi rilevanti per la malattia.

cathepsin B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CTSB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cathepsin B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CTSB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CTSB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cathepsin B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CTSB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cathepsin B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cathepsin B nelle cellule tumorali con espressione di CTSB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.