Calpain 7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405085-ACT

Il gene umano **CAPN7** codifica la calpaina 7, una proteasi a cisteina intracellulare non lisosomiale appartenente alla famiglia delle calpaine, che contribuisce alla proteolisi regolata e alla proteostasi. Gli eventi di clivaggio mediati dalle calpaine possono rimodellare complessi del citoscheletro e associati alla membrana, influenzando processi quali il traffico intracellulare, la progressione del ciclo cellulare e le cascate di segnalazione responsiva allo stress. Attraverso un processamento dei substrati dipendente dal contesto, l’attività di CAPN7 può intersecarsi con vie che regolano l’adesione e la motilità cellulare e, più in generale, con le reti di controllo della qualità proteica. Una segnalazione proteasica deregolata e uno squilibrio della proteostasi sono comunemente osservati nel cancro e nella neurodegenerazione, rendendo CAPN7 un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sulla regolazione proteolitica nelle cellule umane.

Calpain 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CAPN7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Calpain 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CAPN7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CAPN7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Calpain 7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CAPN7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Calpain 7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Calpain 7 nelle cellule tumorali con espressione di CAPN7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.