c-Fgr Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420347-ACT

Il gene Fgr del topo codifica c-Fgr, una tirosin-chinasi non recettoriale della famiglia Src, arricchita nelle linee mieloidi, che trasduce segnali a valle di immunorecettori, integrine e stimoli citochinici per coordinare le risposte immunitarie innate. c-Fgr partecipa a cascate di fosforilazione che regolano il rimodellamento del citoscheletro di actina, l’adesione e la migrazione cellulare, la fagocitosi e la produzione di specie reattive dell’ossigeno, integrandosi con vie quali la segnalazione dei recettori Fc e le reti di chinasi infiammatorie. Un’attività deregolata delle chinasi della famiglia Src, inclusa un’alterata segnalazione di Fgr, è stata collegata ad attivazione leucocitaria aberrante e a fenotipi infiammatori, rendendo Fgr un nodo utile per lo studio dell’omeostasi immunitaria e della funzione delle cellule mieloidi. In biologia del cancro, l’espressione e la segnalazione di Fgr sono inoltre oggetto di studio per il possibile ruolo nelle cellule mieloidi associate al tumore e nelle dinamiche di segnalazione del microambiente.

c-Fgr Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Fgr senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

c-Fgr Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Fgr nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Fgr, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di c-Fgr. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Fgr nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da c-Fgr nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via c-Fgr nelle cellule tumorali con espressione di Fgr silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.