BUBR1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403807-ACT

BUB1B codifica BUBR1, un componente fondamentale del checkpoint di assemblaggio del fuso mitotico, che salvaguarda la segregazione dei cromosomi monitorando l’attacco cinetocoro–microtubulo e regolando l’attività dell’APC/C attraverso il complesso di checkpoint mitotico. BUBR1 contribuisce alla tempistica della mitosi, alla coesione delle cromatidi sorelle e alla correzione degli errori, mantenendo così la stabilità del genoma durante la divisione cellulare. Una funzione deregolata di BUB1B/BUBR1 è associata a instabilità cromosomica e aneuploidia, caratteristiche frequentemente studiate in biologia del cancro e nei disturbi dello sviluppo che coinvolgono il controllo del ciclo cellulare. In quanto regolatore del checkpoint, BUBR1 viene anche utilizzato come nodo meccanicistico per indagare le risposte allo stress mitotico e fenotipi dipendenti dalla proliferazione.

BUBR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BUB1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BUBR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BUB1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BUB1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BUBR1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BUB1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BUBR1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BUBR1 nelle cellule tumorali con espressione di BUB1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.