BPAG1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403388-ACT

DST codifica l’antigene 1 del pemfigoide bolloso (BPAG1), una grande proteina citolinker che collega i filamenti intermedi a complessi associati alla membrana e sostiene l’organizzazione del citoscheletro, il trasporto vescicolare e la resilienza meccanica cellulare. Le isoforme umane di BPAG1 sono particolarmente espresse negli epiteli stratificati e nei neuroni, dove contribuiscono a mantenere l’integrità degli emidesmosomi e a stabilizzare l’adesione cellula–matrice. Attraverso questi ruoli strutturali, BPAG1 influenza processi quali migrazione, polarità e segnalazione di risposta allo stress, che dipendono da un crosstalk coordinato tra actina, microtubuli e filamenti intermedi. La disregolazione o un’antigenicità alterata di BPAG1 è associata a patologie cutanee bollose e a fenotipi neurodegenerativi, rendendo DST un bersaglio utile per lo studio della disfunzione del citoscheletro e dei meccanismi di fragilità tissutale.

BPAG1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DST senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BPAG1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DST nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DST, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BPAG1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DST nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BPAG1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BPAG1 nelle cellule tumorali con espressione di DST silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.