BMAL1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419206-ACT

Arntl codifica BMAL1, un fattore di trascrizione PAS di base con motivo elica–ansa–elica, componente centrale dell’orologio circadiano, che forma un eterodimero con CLOCK per guidare i programmi di espressione genica circadiana nei tessuti murini. BMAL1 regola la trascrizione ritmica di geni controllati dall’orologio coinvolti nel metabolismo, nel controllo del ciclo cellulare, nelle risposte al danno al DNA e nella segnalazione immunitaria, integrando gli stimoli ambientali con la fisiologia cellulare. Attraverso la modulazione di circuiti di feedback trascrizionale che coinvolgono le proteine PER e CRY, BMAL1 influenza la funzione mitocondriale, la gestione dello stress ossidativo e l’omeostasi endocrina. Un’attività deregolata di BMAL1 è stata associata a ritmi circadiani alterati e a fenotipi correlati in modelli di disfunzione metabolica, infiammazione e biologia tumorale, a supporto della sua utilità nella ricerca meccanicistica.

BMAL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Arntl senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BMAL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Arntl nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Arntl, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BMAL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Arntl nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BMAL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BMAL1 nelle cellule tumorali con espressione di Arntl silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.